這是通訊作者單位完全來自國內的首篇四通道動態(tài)LED陣列近紅外光譜儀DUAL-KLAS-NIR應用文獻。
光合作用是植物和藻類將光能轉化為化學能的核心過程，但其效率受限于動態(tài)光環(huán)境的影響。在高光強下，光系統(tǒng)II(PSII)到光系統(tǒng)I(PSI)的電子傳遞鏈(ETC)易產生電子堆積，導致活性氧(ROS)生成，進而損傷光合機構(如PSII核心蛋白D1、RuBisCO等)。為應對高光脅迫，植物和藻類進化出了短期保護機制(如非光化學淬滅NPQ)和長期適應策略(如調整光系統(tǒng)復合體的比例)。然而，質體藍素(Plastocyanin, PC)作為類囊體腔內的可溶性電子載體，其在高光適應中的作用尚不明確。
質體藍素PC位于細胞色素b6f復合體(Cytb6f)與PSI之間，參與線性電子流(LEF)和環(huán)式電子流(CEF)。此前研究表明，PC水平與光合電子傳遞(PET)效率相關，但其調控機制仍不清楚。例如，擬南芥中PC過量表達可增強植物生長和抗逆性，但其對光合碳固定和高光耐受的具體作用仍需深入探究。
2025年3月21日，Communications Biology在線發(fā)表深圳大學李曉政&胡章立教授團隊，中科院植物所楊文強研究員課題組合作完成的，標題為“Plastocyanin affects photosynthesis and high light acclimation by modulating redox states of electron transport chain in Chlamydomonas reinhardtii”的研究論文。本研究以模式綠藻萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)為實驗對象，通過構建PC過表達(OEPC)和敲低(pckd)株系，系統(tǒng)解析質體藍素PC通過調節(jié)電子傳遞鏈(ETC)氧化還原狀態(tài)影響光合效率和高光適應的分子機制。
實驗材料：萊茵衣藻野生型株系為CC849(自有)和CC5352(美國明尼蘇達大學衣藻資源中心)，過表達株系OEPC以及敲低株系pckd。
光合活性測量：使用雙通道葉綠素熒光儀DUAL-PAM-100測量樣品(2 mL,30 μg Chl)的PSII實際量子產率(Y(II))、電子傳遞速率(ETR(II))及非光化學淬滅(NPQ)。通過QA還原水平間接評估PQ庫還原狀態(tài)。通過DUAL-PAM-100近紅外差示吸收分析P700氧化狀態(tài)(Pm, Pm', P700ox, Y(I), Y(ND), Y(NA))及環(huán)式電子傳遞(CEF)活性。通過JTS-10光譜儀分析P700、Cytf和PC氧化還原狀態(tài)；通過四通道動態(tài)LED陣列近紅外光譜儀DUAL-KLAS-NIR測量PC、Fd和P700的氧化還原吸收光譜。通過氧電極法測量暗適應(5min)細胞在200 μmol m?2 s?1光強下照射5分鐘的氧氣釋放速率。
除此之外，本研究還進行了藻株生長速率曲線和總葉綠素相關的生長測量，超氧陰離子(O2?)生成相關的ROS檢測，免疫印跡分析，透射電鏡(TEM)觀察類囊體膜結構及淀粉顆粒含量，RuBisCO和ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)活性測量。過表達OEPC株系與野生型株系轉錄組測序，比較的基因表達差異。
研究人員首先對PC過表達株系的生長特征進行了研究。生長優(yōu)勢分析顯示過表達株系OEPC在固體和液體培養(yǎng)基中均表現出更快的生長速率(圖1C、D)，且在400 μmol m?2 s?1高光下無明顯生長抑制，而野生型株系(CC849)則生長顯著延遲(圖6A)。
圖1 不同PC水平的C. reinhardtii表型。
光合效率提升方面，過表達OEPC株系的放氧速率較野生型提高33%(圖1E)。葉綠素熒光數據顯示OEPC過表達株系的PSII實際光化學量子產率Y(II)和相對電子傳遞速率ETR(II)都高于野生型CC849(圖2A、C)，而pckd中則低于CC5325(圖 2B，D)。光曲線測量NPQ的結果顯示，OEPC株系的Y(NPQ)明顯高于野生型CC849，而在pckd中僅略高于CC5325(圖 2E，F)。誘導曲線+暗弛豫的測量結果顯示OEPC的NPQ在光照的前100秒內達到0.8的較高水平，然后相對穩(wěn)定地保持在0.7和0.8之間。CC849的NPQ最初上升到0.6的較低水平，然后下降到0.4，隨后上升到1.0的最高水平(圖2G)。而CC5325 的NPQ在100秒時先達到0.6，然后下降到0.3，隨后恢復到0.7并保持相對穩(wěn)定(圖2H)。P700近紅外差示吸收測量PSI氧化還原和電子傳遞的結果顯示，OEPC的ETR(I)比CC849高48%，而pckd比CC5325低17%(圖2J)。根據受體側限制Y(NA)的評估，OEPC中較大的ETR(I)并沒有對PSI受體產生很大的還原壓力。相反，在OEPC中觀察到的Y(NA)低于CC849，而在pckd中檢測到的Y(NA)高于CC5325(圖2I)。此外，OEPC的供體側限制Y(ND)比CC849大，而pckd和CC5325的Y(ND) 沒有明顯差異。因此，Y(I)在OEPC中增加，而在pckd中減少。
圖2 PSII和PSI的光合參數。
免疫印跡分析表明，與野生型相比，OEPC中LHCSR3蛋白含量明顯降低，而pckd中則有所增加(圖S4)。此外，與野生型相比，LHCSR3.1和LHCSR3.2的基因表達水平在OEPC 中降低，而在pckd中上調(圖S3)。
補充圖S3 過表達和野生型株系中捕光天線復合體蛋白基因的表達水平。補充圖S4 CC849、OEPCs、CC5325和pckd株系中LHCSR3蛋白水平的變化。
進一步研究PC調控ETC氧化還原狀態(tài)的相關結果表明，PQ庫還原水平降低，OEPC中QA的還原程度低于野生型(圖3A)，表明PC過表達減少了PQ池的過度還原。DUAL-KLAS-NIR分析顯示PC氧化水平升高，OEPC中PC的氧化比例(PC?)顯著增加(表2)，尤其在800 μmol m?2 s?1下，PC氧化比例達69%(野生型為56%)。此外，過表達株系OEPC中Fd的還原程度降低(圖3G、I、K)，可能與碳同化增強有關。
圖3 ETC組分的氧化還原狀態(tài)及ROS產生。
補充圖S6 P700、Fd和PC差分模型圖(DMP)原始數據。(A)P700差分模型圖是通過每20s施加一次的多周轉閃光脈沖(光強13000 μmol m?2 s?1，持續(xù)時間50ms)測量，并對25次測量進行平均后得到的； (B) Fd差分模型圖是通過600 ms光照(1350 μmol m?2 s?1)和30s的黑暗間隔測量，并對20次測量進行平均后得到的；(C) PC差分模型圖使用KLAS軟件自帶的默認協(xié)議進行測量。
類囊體結構緊密性分析的TEM觀察結果顯示過表達株系OEPC的類囊體膜堆疊比 野生型CC849 更緊密，而pckd表現出比CC5325更松散的膜結構。淀粉顆粒含量方面，OEPC細胞的淀粉含量顯著低于CC849，而pckd細胞的淀粉水平高于CC5325(圖4B)。
圖4 透射電鏡(TEM)下的細胞結構。
ROS生成與碳代謝方面的研究結果顯示，ROS水平降低，NBT染色顯示，OEPC在高光下產生的超氧陰離子顯著少于野生型(圖3M)。碳固定增強：RuBisCO活性在OEPC中顯著升高(圖5B)，且CBB循環(huán)相關基因(如RBCS、GAP3)表達上調。淀粉合成抑制：AGPase活性下降(圖5C)，細胞淀粉含量減少，可能與Fd還原水平降低導致的Fd-TRX系統(tǒng)活性下降有關。
圖5 卡爾文循環(huán)和淀粉合成相關基因與酶活。
進一步的研究評估了高光適應中的PC動態(tài)積累。PC誘導表達結果顯示，野生型CC849在高光(400 μmol m?2 s?1)下培養(yǎng)4天后，PC含量顯著積累(圖6E)，同時QA還原水平逐漸下降(圖6F)。光系統(tǒng)II修復增強：OEPC的PSII最大量子效率(Fv/Fm)在高光下保持穩(wěn)定，而野生型需數天恢復(圖6I)。
圖6 高光耐受性與PC積累的動態(tài)關系。
基于上述研究總結出PC調控光合作用的分子機制模型。PC作為氧化還原電容器通過緩沖電子流，維持PQ和Fd的低還原狀態(tài)，減少ROS生成(圖7B)。此外，降低的Fd還原水平抑制淀粉合成，促進碳流向生長相關代謝，實現碳分配優(yōu)化(圖7B)。
PC通過調節(jié)ETC氧化還原狀態(tài)增強光合效率：PC過表達增加了PC池的氧化能力(PC?比例升高)，加速了PQH2在Cytb6f復合體的氧化，從而維持PQ池的低還原狀態(tài)。這緩解了PSII供體側的電子堆積，減少了ROS生成(如超氧陰離子)，并促進LEF和ATP合成。此外，Fd還原水平的降低可能通過抑制Fd-TRX系統(tǒng)，減少淀粉合成，使更多碳流向CBB循環(huán)，增強CO2固定(圖5B)。
PC在高光適應中的雙重作用：短期高光脅迫下，PC通過增強ΔpH(跨膜質子梯度)提高qE型NPQ，快速耗散多余光能(圖2E)。長期高光暴露則誘導PC積累，通過轉錄調控(如LHCB基因上調)優(yōu)化光能捕獲，并維持PSII修復能力(圖6I)。這種動態(tài)調控使藻細胞在高光下實現生長與光保護的平衡。
PC與碳代謝的偶聯：淀粉含量減少是OEPC的顯著特征(圖4)。作者提出，低Fd還原水平抑制了AGPase活性，而CBB循環(huán)的增強進一步將碳通量導向生物量合成而非儲存。這種代謝重編程可能在自然環(huán)境中幫助藻類適應光強波動，避免碳儲存過量對生長的反饋抑制。
PC調控的分子網絡：轉錄組分析顯示，PC過表達導致光合天線蛋白、CBB循環(huán)及葉綠素代謝相關基因顯著上調。例如，LHCB家族基因的表達增加可能增強了光捕獲能力，而RBCS和GAP3的上調直接促進碳固定。這些變化共同構成了PC介導的光合優(yōu)化網絡。
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